13ª PRÁCTICA

21/02/2020
PRÁCTICA Nº13: "DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE HIERRO"

OBJETIVO

• Determinar la concentración de hierro presente en una muestra de plasma de un paciente mediante el método FerroZine Colorimétrico y espectrofotometría.

FUNDAMENTO
El hierro se disocia del complejo sérico hierro-transferrina en medio ácido débil.
El hierro libre se reduce a ión ferroso mediante el ácido ascórbico. Los iones ferrosos en presencia de FerroZine forma un complejo coloreado:
Transferrina (Fe 3+) 2 + e- -------------------> 2 Fe 2+ + Transferrina
                                           Ácido ascórbico
Fe 2+ -----------> Complejo coloreado
           FerroZine
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración del hierro en la muestra ensayada.

SIGNIFICADO CLÍNICO
El hierro es el constituyente de un gran número de enzimas. La mioglobina, proteína muscular, contiene hierro, así como el hígado.
El hierro es necesario para la producción de hemoglobina, molécula que transporta el oxígeno en el interior de los glóbulos rojos. Su déficit causa anemia ferropénica. Se encuentran niveles elevados de hierro en la hemocromatosis, cirrosis, hepatitis aguda y en concentraciones altas de transferrina. La variación día a día es común en poblaciones sanas.

MATERIAL NECESARIO

• Pipetas automáticas de 20-200 microlitros y de 100-1000 microlitros.
• Puntas de pipeta amarillas y azules.
• Agua destilada.
• Gradilla.
• 4 tubos de ensayo.
• Cubetas de espectrofotometría.
• Bote de orina ("contenedor de desechos").
• Papel para limpiar las paredes de las cubetas antes de su medición en el espectrofotómetro.
  
  
  
  

APARATOS

• Baño termostático o baño María.
• Espectrofotómetro.

REACTIVOS

• R1 Tampón: Acetato pH 4'9.
• R2 Reductor: Ácido ascórbico.
• R3 Color: FerroZine.
• IRON CAL: Patrón primario acuoso de Hierro 100 microgramos/ dL.
  

MUESTRA

• Plasma heparinizado.

PROCEDIMIENTO

1. En primer lugar, preparar el Reactivo de Trabajo. Para ello, disolveremos el contenido del reactivo 2 en el bote del reactivo 1. Tapar y mezclar hasta disolver su contenido.
2. Rotular 4 tubos de ensayo como "B, P, BM y M" (Blanco, Patrón, Blanco Muestra y Muestra).
3. Depositar 1 mL del reactivo de trabajo (solución en el bote de R1) en cada uno de los 4 tubos de ensayo.
   
   
   
   
   
4. Echar 1 gota de R3 en todos los tubos de ensayo excepto en el de Blanco Muestra.
   
5. Depositar 200 microlitros de agua destilada en el tubo marcado como "B" (Blanco).
   
   
   
6. 200 micolitros de IRON CAL en el tubo marcado como "P" (Patrón).
   
   
   
7. Echar 200 microlitros del plasma del paciente en los tubos del Blanco Muestra y Muestra.
   
   
   
8. Mezclar, tapar los tubos con tapones azules para éstos e incubar 5 minutos a 37ºC en el baño termostático o baño María.
   
9. Leer las absorbancias a 562 nm del Patrón y la Muestra frente al Blanco del Reactivo. El color es estable como mínimo 30 minutos.
   
   
   

CÁLCULOS

RESULTADO
- Absorbancia Muestra: 0'162 A.

- Absorbancia Blanco de Muestra: 0'140 A.

- Absorbancia del Patrón: 0'094 A.

(0'162 A - 0'140 A) / 0'094 A x 100 = 23'40 microgramos / dL de hierro.

VALORES DE REFERENCIA

• Hombres: 65-175 microgramos/dL.
• Mujeres: 40-150 microgramos/ dL.

OBSERVACIONES

•  Desechar las muestras hemolizadas, ya que los hematíes contienen hierro y pueden dar falsos resultados positivos.
• La calibración con el Patrón acuoso puede dar resultados erróneos sistemáticos.

CAUSA-ERROR Y CONCLUSIÓN

• El resultado obtenido se encuentra por debajo de los valores normales, esto puede deberse a algún error de pipeteo o que el paciente presenta anemia ferropénica.