9ª PRÁCTICA

11/02/2020
PRÁCTICA Nº9: "DETECCIÓN DE LA REACCIÓN DE LA PEROXIDASA EN LEUCOCITOS"

OBJETIVOS

• Es utilizado para el diagnóstico celular en la medicina humana.
• Se emplea en el examen hematológico y citológico de muestras de origen humano.
• Se utiliza para la visualización de estructuras de destino (mediante fijación, tinción) en material de examen hematológico y clínico-citológico.
• Contiene todos los reactivos necesarios para detección de la reacción de la peroxidasa en leucocitos.

FUNDAMENTO
La reacción de peroxidasa, en particular la reacción citoquímicamente significativa de mieloperoxidasa, sirve de indicador para la presencia de elementos celulares mieloicos. El grado de madurez de los granulocitos en maduración puede ser estimado esencialmente según la intensidad de la reacción cromática pardo-negruzca.
Las peroxidasas son catalasas lisosomales que transfieren el hidrógeno desde un donador adecuado (anteriormente la bencidina cangerígena, aqui: 4-cloro-1-naftol) a un peróxido (aquí: peróxido de hidrógeno). Entonces el donador 4-cloro-1-naftol se oxida y se tranforma en un colorante insoluble pardo negruzco, que puede utilizarse como indicador de la correspondiente actividad de peroxidasas.

MATERIAL NECESARIO

• Papel o algodón.
• Alcohol 70.
• Lancetas.
• Capilares heparinizados.
• Portaobjetos.
• Probeta de 250 mL.
• Barras paralelas.
• Cubetas de tinción.
• Cubetas de Hellendahl.
• Etanol.
• Agua destilada.
• Pipeta graduada de 20 mL y auxiliar de pipeteado rojo.

REACTIVOS

• R1: 4-Cloro-1-naftol (12 x 5 mL).
• R2: Tris (hidroximetil) aminometano-HCl solución tampón (10 mL).
• R3: Solución de peróxido de hidrógeno (5 mL).

PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
Se necesitan frotis de sangre finos, secados al aire y guardados como máximo durante 3 días. Para ello:

1. Desinfectar la zona del dedo donde se vaya a realizar la punción para obtener sangre capilar con ayuda de un papel impregnado en alcohol 70º.
2. Secar la zona y pinchar la zona en la zona lateral del dedo.
   
3. Recoger la sangre en capilares heparinizados (recoger la sangre por el extremo que no lleve la raya roja). En total, hemos obtenido con mi sangre 5 capilares.
   
4. Depositar 1-2 gotas de la sangre del capilar en un extremo de un porta, colocar otro porta encima de éste de forma que presenten un ángulo de 70º aproximadamente, arrastrar el porta vertical un poco hacia atrás, esperar que el extremo se llene por capilaridad con la sangre y hacer un movimiento constante y rápido hacia adelante (MÉTODO DE LA CUÑA).
   
5. En total, dispongo en mi caso de 6 frotis sanguíneos. Dejar que se sequen a temperatura ambiente.
   

A continuación, preparar el fijador que se compone de 9 partes de Metanol y 1 parte de Formol. Por tanto, debemos depositar en una probeta de 250 mL, 180 mL de Metanol y 20 mL de Formol. Para ello, coger 20 mL con una pipeta graduada de Formol y depositarlos en la probeta, y posteriormente enrasar en los 200 mL con Metanol.

Posteriormente, sumergir uno de los frotis sanguíneos previamente preparados, en el fijador durante 2 minutos.

Colocar el frotis una vez fijado sobre unas paralelas situadas cobre una cubeta de tinción y enjuagar el frotis con agua destilada durante 10 segundos.

Secar al aire.

PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN DE TINCIÓN

1. Añadir 1 mL de Etanol en el bote de 4-Cloro-1-naftol y homogeneizar.
   
   
   
   
2. Depositar 14 mL de Etanol en una cubeta Hellendahl y abocar el bote del reactivo 1.
   
3. Añadir 45 mL de agua destilada y 10 gotas del reactivo 2 removiendo continuamente.
   
   
   
   
4. Depositar 2 gotas del reactivo 3. 
   

La solución de tinción preparada es incolora y utilizable durante 3 horas.

PROCEDIMIENTO

1. Introducir el frotis fijado en solución de la tinción recién preparada durante 10 minutos. 
   
2. Enjuagar con agua destilada sobre las paralelas durante 10 segundos. Escurrir bien el porta por goteo para quitar el exceso.
3. Secar a temperatura ambiente.
4. Una vez seco, introducir el frotis en la contratinción con hemalumbre en solución durante 2 minutos.
   
5. Enjuagar el frotis con agua corriente del grifo durante 3-5 minutos.
6. Secar al aire.

RESULTADOS (13/02/2020)
Todas las células de la serie de maduración neutrófila y especialmente de la eosinófila a partir de los promielocitos son claramente peroxidasa-positivas, si se ven gránulos con tinción pardo-negruzca.
Los granulocitos basófilos así como todas las células de las series linfática y eritropoyética son peroxidasa-negativas.
Las poblaciones leucémicas de blastos que reaccionan de forma peroxidasa positiva en su parte o en su totalidad son indicadores de la leucemia mieloide aguda.

CAUSA-ERROR
A la hora de realizar los frotis, se han producido varios errores, ya sea por haber echado poca cantidad de sangre, no he deslizado el porta a una velocidad constante, los portaobjetos pueden tener algo de suciedad, etc.
 
OBSERVACIONES

• Son muy importantes los tiempos de tinción y de lavado, ya que un exceso o insuficiencia de colorante, puede influir bastante a la hora de visualizar la preparación al microscopio.
• Las preparaciones deben estar bien secas en el paso de un colorante y otro para evitar el arrastre de las células.