4ª PRÁCTICA

13/12/2019
PRÁCTICA Nº4: "DETERMINACIÓN DE COOMBS INDIRECTO"

OBJETIVO

• Investigar la presencia de anticuerpos irregulares o incompletos en el suero del paciente enfrentándolos, primeramente, a hematíes específicos tipados y, posteriormente, a la AGH para su detección.

FUNDAMENTO
Se le llama también prueba de la antiglobulina indirecta (PAI). Sirve para la determinación de Anti-D, Ig G incompletos en plasma o suero. Se hace a madres Rh - que pueden estar sensibilizadas por incompatibilidad Rh materno-fetal o por transfusión incompatible.
En un primer tiempo se ponen en contacto hematíes con antígeno D con el plasma problema. Si existen anti-D en dicho plasma, se produce la unión aunque no la aglutinación. Tras incubar, se añade la antiglobulina. Ésta hace de puente de unión entre complejos Ag-Ac y se visualiza la aglutinación.

MATERIAL NECESARIO

• Tubos de ensayo de 3 mL.
• Pipeta automática de 100-1000 microlitros.
• Pipetas Pasteur.
• Puntas de pipeta azules.

REACTIVOS

• AGH.
• Solución Salina Fisiológica.
• Hematíes tipados del grupo 0+.

APARATAJE

• Centrífuga.
• Baño María.
• Visualizador.

PROCEDIMIENTO
1º) PREPARACIÓN DE LOS HEMATÍES TIPADOS 0+ (DILUCIÓN AL 5%).

1. Depositar 500 microlitros de sangre 0+ en un tubo de ensayo de 3 mL.
   
   
   
   
2. Llenar completamente el tubo de 3 mL que contiene la sangre con Solución Salina Fisiológica y taparlo con un tapón.
   
3. Centrifugar a 2.500 r.p.m. durante 1 minuto.
   
4. Desechar el sobrenadante con una pipeta Pasteur.
   
5. Repetir el procedimiento 2 veces más desde el paso 2.
   

2º) DETERMINACIÓN DE COOMBS INDIRECTO

1. En un tubo de ensayo, añadir 0'1 mL del concentrado de hematíes (4 gotas). Posteriormente, añadir 1'9 mL de Solución Salina Fisiológica (SSF). Mezclar por inversión.
   
2. Depositar en otro tubo de ensayo, 4 gotas del suero problema y 4 gotas de la suspensión de hematíes tipados 0+ al 5%.
   
   
   
   
   
   
   
3. Incubar en el baño María durante 20 minutos.
   
4. Añadir 1000 microlitros de Solución Salina Fisiológica al tubo con las 8 gotas anteriores.
5. Desechar el sobrenadante.
   
   
   
   
6. Echar 4 gotas de antiglobulina humana (AGH).
   
7. Centrifugar a 2.500 r.p.m. durante 1 minuto.
   
8. Resuspender el sedimento obtenido con el último lavado dando pequeños golpecitos en el fondo del tubo.
9. Observar la presencia o ausencia de aglutinación en el visualizador.
   

RESULTADOS
LECTURA DE RESULTADOS

• El resultado ha sido negativo debido a que los hematíes permanecen en forma de suspensión homogénea de color rojizo y, por tanto, no se visualiza aglutinación.

 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS FINALES DE LA DETERMINACIÓN REALIZADA Y VALORACIÓN

• Ante una prueba indirecta negativa, se efectúa un control positivo con hematíes revestidos con anticuerpos conocidos que producirán aglutinación positiva con la AGH, y confirmará que, anteriormente, en el suero problema no existían anticuerpos irregulares que se unieran a los hematíes 0+. Para ello:

1. Depositar 4 gotas de antiglobulina humana (AGH) y 4 gotas de "Coombs Control IgG" en un tubo de ensayo.
   
   
   
   
   
2. Incubar en el baño María durante 20 minutos.
   
   
   
   
3. Resultado: Control -. Esto puede deberse a que los reactivos estaban caducados.
   

OBSERVACIONES

• Es muy importante respetar los tiempos que se requieren en cada caso. Por ello, debemos estar atentos y servirnos de un cronómetro.
• La prueba puede dar falsos positivos por contaminación bacteriana de la solución salina, hematíes y/o reactivos; también por exceso de centrifugación.
• Los falsos negativos se pueden presentar por un lavado inadecuado, tiempos de incubación insuficientes, un mal control de temperatura, y por no utilizar el suero de antiglobulina humana apropiado.

CONCLUSIONES

• Mediante esta prueba, si se realizara en todas las parejas cuya sangre fuera compatible por el sistema ABO, utilizando el suero de la madre y los hematíes del padre, se podría detectar en la madre cualquier tipo de anticuerpo incompleto producido por sensibilización ante antígenos procedentes del feto que éste heredase del padre.