10ª PRÁCTICA

11/02/2020
PRÁCTICA Nº10: "IDENTIFICACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA FOSFATASA ALCALINA EN LEUCOCITOS"

UTILIDAD CLÍNICA
Kit de reactivos citoquímicos para diagnóstico de la leucemia.
Es utilizado para el diagnóstico celular en la medicina humana, se emplea en el examen hematológico y citológico de muestras de origen humano. Se trata de un kit de tinción que se utiliza para la visualización de estructuras de destino (mediante fijación, tinción, dado el caso contratinción, montaje) en material de examen hematológico y clínico-citológico.
Está previsto para la reacción en la cubeta de Hellendahl y contiene todos los reactivos necesarios para identificación de la actividad de la fosfatasa alcalina (ALPA) en leucocitos.

FUNDAMENTO
Para la delimitación citoquímica de una leucemia mieloica crónica (CML) de otras enfermedades del tipo de formas mielo-proliferativas, especialmente frente a la mielofibrosis y la policitemia o, respectivamente, otros procesos inflamatorios o tumorosos, es adecuada la determinación de la actividad (indice) de la fosfatasa alcalina leucocitaria. Además, el índice de la fosfatasa alcalina de leucocitaria representa un parámetro sencillo del transcurso en el caso de CML, que refleja diversas fases de actividad de la enfermedad hematológica.
La fosfatasa alcalina de leucocitaria cataliza la hidrólisis de ésteres fosfóricos en medio alcalino. El 1-naftol liberado a partir del fosfato de 1-naftilo se acopla con una sal de diazonio para dar lugar un azocolorante pardo, que precipita en la célula de acuerdo con la localización y la actividad de la fosfatasa alcalina en la célula.

MATERIAL NECESARIO

• Probeta de 100 mL.
• Matraz Erlenmeyer.
• Papel de filtro.
• Vaso de precipitados.
• Pipetas graduadas y auxiliar de pipeteado.
  

REACTIVOS

• R1: Tris (hidroximetil)-aminometano.
• R2: Fosfato de 1-naftilo sal sódico.
• R3: Variamin sal azul B.
  

MUESTRA

• Frotis previamente realizados para la práctica anterior.

PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

1. Los frotis sanguíneos frescos ya secos, se deben fijar con una mezcla ya preparada  que contiene 180 mL de Metanol y 20 mL de Formol.
2. Dejar sumergidos los frotis en la fijación durante 2 minutos y después enjuagar con agua del grifo durante 10 segundos.
3. Secar al aire los frotis completamente.

PREPARACIÓN DE REACTIVOS

• SOLUCIÓN A:
• Añadir con la cuchara de la que dispone el kit, 4 cucharadas dosificadoras rasas del reactivo 1.
  
• Posteriormente, añadir 100 mL de agua destilada.
  
• Remover hasta disolver la solución completamente.

• SOLUCIÓN B:
• Depositar el contenido completo del frasco del reactivo 2 + 15 mL de la solución A. 
  
  
  

• SOLUCIÓN DE TINCIÓN:
• Añadir 45 mL de solución A + Contenido completo del reactivo 3.
• Agitar intensamente durante 2 minutos.
  
• Filtrar a través de un filtro de papel la solución B.
  
• Mezclar completamente.
  

PROCEDIMIENTO

1. Una vez fijado el frotis (como en la práctica anterior), sumergir completamente los frotis en la solución de tinción recién preparada durante 30 minutos.
   
   
   
   
2. Cubrir los frotis durante 5 minutos con agua destilada.
3. Posteriormente, introducir las muestras en la contratinción con hemalumbre durante 5 minutos.
   
   
   
   
4. Enjuagar con agua corriente del grifo durante 5 minutos.
5. Secar completamente al aire y guardarlos en una caja todos juntos hasta el próximo día que leamos los resultados.

RESULTADO (13/02/2020)
El producto de reacción pardo se encuentra solamente en las etapas de maduración final de la granulopoyesis. Son evaluados 100 segmentos neutrófilos; en cada caso de una neutropenia como máximo hasta un 10% de granulocitos con núcleo en banda.
El recuento tiene lugar según el grado de intensidad de la tinción.

CAUSA-ERROR
Las imágenes de las preparaciones de esta práctica se ven más claras que las de la práctica anterior. Esto puede deberse a que no haya cumplido adecuadamente algún tiempo de tinción o contratinción.


OBSERVACIONES

• Son muy importantes los tiempos en cada paso de la realización de la práctica puesto que podemos ocasionar que se vean los resultados más o menos bien.
• Si se multiplican los números de porcentaje encontrados por las cifras de las clases de reacción que corresponden en cada caso y se suman los productos se obtiene el índice de ALPA.
• Un indice disminuido es patognomónico para la fase de enfermedad activa de una leucemia crónica mieloica.